بهینه سازی روش HRM-Real Time PCR برای تشخیص کرم قلب

مطالعه اکولوژی انگلهای سگ های ولگرد از اهمیت زیادی برخورداراست. باتوجه به  امکان انتقال انگل های مشترک از سگ های ولگرد به انسان، این انگل ها از جمله خطرات بالقوه جوامع انسانی امروز محسوب می شود که نیاز به مطالعات جامع دارد. دیروفیلاریا ایمیتیس انتشار جهانی دارد و ایران یکی از مناطق اندمیک برای این آلودگی است.ازاین رو، تحقیق حاضر با هدف بررسی آلودگی به دیروفیلاریا ایمیتیس در سگ ها ی ولگرد استان های گیلان، قزوین وما زندران با استفاده از روش HRM Real -Time PCR و مقایسه آن با روش PCR معمولی انجام شد. مهمترین سوال تحقیق این بود که: آیا روش  HRM Real -Time PCRقادر به تفریق گونه های فیلرهای آلوده کننده سگ در ایران و همچنین قادر به تشخیص عفونت مخفی است؟به این منظوردر بررسی حاضر، نمونه خون های حاوی ضد انعقاد از 138 قلاده سگهای ولگرد در استانهای گیلان، مازندران و قزوین با روش مولکولی مورد ارزیابی قرار گرفتند.دراین مطالعه  قسمتی از ژنcoxI دیروفیلاریا ایمیتیس (به طولbp 256 ) تکثیر گردید. روش HRM Real -Time PCRبا استفاده از دستگاه روتورژن انجام شد. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در مجموع از 138 نمونه جمع آوری شده ازسه استان گیلان، مازندران و قزوین با روش  PCR معمولی وHRM Real -Time PCR  8/47 % از نمونه ها مثبت شدند.  در مطالعه حاضر حساسیت روش PCR وHRM Real -Time PCR100 % حاصل شد (حساسیت و ویژگی براساس روش استاندارد طلایی  PCR و تعیین توالی قطعه های تکثیر شده، محاسبه شد)ویژگی هردوروش 100% است. نتایج HRM Real -timePCR نشان داد که PCR براساس ژن coxI انگل  قادر به تشخیص آلودگی است. نمونه هایی کهPCR  مثبت بودند، دارای میانگین دمای ذوب ºc 66/ 76بودند ، این توالی ها در سطح نوکلئوتید اختلاف 2-1 % داشتند، اما ترجمه این توالی ها به اسید آمینه تشابه 100% نشان داد، به عبارت دیگر دمای ذوب قادر به تفریق 2-1%اختلاف درسطح نوکلئوتید بود. اما در نمونه های  مورد بررسی در مطالعه حاضر اختلافی در سطح گونه دیروفیلاریا ایمیتیس یا احتمال سویه زایی مشاهده نشد. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که به منظور تشخیص آلودگی سگها به دیروفیلاریازیس لازم است روشهای ملکولی بکارگرفته شوند و روش HRM Real-TimePCR  که مبتنی برتغییرات دمای ذوب ناشی از اختلاف در سطح نوکلئوتید ها است، می تواند به منظور تفریق گونه فیلر آلوده کننده استفاده شود.